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Técnicas para o diagnóstico da bronquite infecciosa das galinhas

Renato Luís Luciano

O Brasil é um dos principais países produtores de carne de frango, sendo que em 2009 produziu 10,9 milhões de toneladas, o que corresponde a 15,3% da produção mundial. Atualmente, o país é o terceiro maior produtor e o maior exportador de carne de frango, comercializando este produto para mais de 150 países.

Os dados acima mencionados revelam a importância desta atividade para a economia nacional e como se faz necessário conhecer e controlar a ocorrência das doenças que acometem as aves.

Neste contexto, a bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença viral, de caráter agudo, altamente infecciosa, sendo comum em países com grandes plantéis de aves comerciais. Surtos da doença acarretam prejuízos econômicos para a indústria avícola devido à perda de peso e à diminuição da conversão alimentar das aves, além de provocarem quedas na produção e na qualidade dos ovos.

A BIG foi observada pela primeira vez em 1930, no estado norte-americano de Dakota do Norte, sendo descrita por Shalk e Hawn. No Brasil, a doença foi diagnosticada inicialmente por Hipólito, em 1957.

O vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBI), agente etiológico desta enfermidade, pertence ao grupo III do gênero Coronavirus da família Coronaviridae. O genoma do VBI é composto por uma fita de RNA simples, não segmentada, com sentido positivo e 27,6 Kb de comprimento. Contém três genes principais responsáveis por codificar as proteínas estruturais desse vírus, isto é, glicoproteína de superfície (S), glicoproteína da matriz (M) e proteína do nucleocapsídeo (N).

O VBI replica-se predominantemente no trato respiratório superior (traqueia e pulmões) e, após a viremia, dissemina-se pelos tratos reprodutivo e intestinal, além de rins e tecido linfoide. Aves de todas as idades são susceptíveis e a transmissão da infecção por esse vírus ocorre por contato direto ou indireto, com morbidade e mortalidade variando de 5 a 20%.

O controle da bronquite infecciosa está fundamentado principalmente em programas de vacinação dos plantéis avícolas com vacinas vivas ou inativadas. No entanto, surtos de infecção pelo VBI continuam ocorrendo em aves vacinadas, devido à baixa proteção cruzada conferida pelas estirpes vacinais em relação às variantes de campo.

Os métodos de diagnóstico convencionais são baseados no isolamento viral em ovos embrionados ou em cultura de órgão traqueal, seguido da técnica de vírus-neutralização, porém tais procedimentos são onerosos e muito demorados. Métodos alternativos de diagnóstico da bronquite infecciosa incluem a reação de imunofluorescência, a técnica de hibridização “in situ”, a microscopia eletrônica, além das provas sorológicas de inibição de hemaglutinação e ELISA com anticorpos monoclonais ou policlonais. No entanto, em algumas dessas técnicas são observados problemas relacionados à especificidade, à sensibilidade, à ocorrência de falhas na detecção, além da subjetividade na análise dos resultados e a impossibilidade de discriminação entre as diferentes estirpes do VBI.

O advento da reação de PCR trouxe importantes fundamentos para a realização dos métodos de diagnóstico laboratorial de agentes infecciosos, redundando em uma melhoria significativa da sensibilidade e especificidade do diagnóstico etiológico de várias doenças infecciosas ou parasitárias. A reação de RT-PCR tem sido amplamente utilizada para se conseguir um meio de diagnóstico rápido, preciso e sensível nas infecções com o VBI. Esta metodologia tem sido empregada isoladamente ou em conjunto com as técnicas de clonagem e sequenciamento de nucleotídeos dos genes mais relevantes do VBI, ou juntamente com os métodos de hibridização em membranas de nitrocelulose com sondas não radioativas, ou da análise de fragmentos genômicos gerados por enzimas de restrição; na técnica denominada RFLP (“restriction fragment length polymorphism analysis”), ou ainda do método de RT-PCR multiplex.

A fim de aumentar a sensibilidade da técnica de RT-PCR na detecção do VBI, foi desenvolvida a reação de Nested-PCR, porém o enorme risco de contaminação com os fragmentos de DNA amplificados de amostras teste, tem tornado essa técnica mais difícil de ser aplicada e rotineiramente adotada.

Em um trabalho conjunto, pesquisadores do Instituto Biológico, Unesp e Embrapa padronizaram um método de diagnóstico baseado na associação entre as técnicas de RT-PCR e ELISA para a detecção do vírus da bronquite infecciosa das aves (VBI). Este ensaio, denominado RT-PCR-ELISA, demonstrou ser 10 vezes mais sensível do que a RT-PCR convencional. Em amostras de pulmão e traqueia obtidas de aves experimentalmente infectadas com duas estirpes do VBI, verificou-se que o RT-PCR- ELISA revelou-se tão específico quanto às técnicas de isolamento viral e Nested- PCR, porém foi menos sensível do que esses mesmos métodos na detecção do VBI. A técnica de RT-PCR-ELISA, utilizada pela primeira vez para o VBI, demonstrou o potencial de se constituir uma alternativa viável para um diagnóstico direto mais rápido e específico do VBI.

O Centro Avançado de Pesquisa Tecnológica do Agronegócio Avícola do Instituto Biológico, sediado em Descalvado, SP, realiza a detecção dos níveis de anticorpos contra o VBI, tanto para a identificação de infecções de campo, quanto para a verificação da resposta imune das aves submetidas aos programas de vacinação contra o VBI. Tal procedimento é adotado por diversas empresas avícolas. Este monitoramento sorológico emprega a técnica de ELISA (Enzyme Linked Oligossorbent Assay).

Referências

Cavanagh, D.; Naqi, A. Infectious Bronchitis. In: Calnek, B.W.; Barnes, H.J.; Beard, C.W.; Reid, W.M.; Yoder Jr., H.W. (Eds). Diseases of Poultry. 10th. Ed. Iowa State University Press, Ames: Mosby-Wolfe, 1997. chap.17, p.511-526.

Gelb Jr., J. Infectious Bronchitis. In: Purchase, H.G.; Arp, L.H.; Domermuth, C.H.; Pearson, J.E. (Eds). A laboratory manual for the isolation and identification of avian pathogens. 3rd. Ed. American Association of Avian Pathologists, Kennett Square: Dubuque, I.W., 1989, p. 124-127.

Ignjatovic, J.; Ashton, F. Detection and differentiation of avian infectious bronchitis viruses using a monoclonal antibody-based ELISA. Avian Pathology, v.25, p. 721-736, 1996.

Luciano, R.L. Desenvolvimento da técnica de RT-PCR-ELISA para a detecção do vírus da Bronquite Infecciosa das Aves (VBI). 2003. 68f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2003.

Luciano, R.L.; Montassier, M.F.S.; Gibertoni, A.M.; Okino, C.H.; Brentano, L.; Montassier, H.J. Desenvolvimento da técnica de PCR-ELISA para a detecção do Vírus da Bronquite Infecciosa das Aves (VBI). Revista Brasileira de Ciência Avícola, Campinas, SP: FACTA, v. supl.5, p.99, 2003. Suplemento. Trabalho apresentado na Conferência APINCO 2003 de Ciência e Tecnologia Avícolas, 2003, Campinas, SP. Resumo.

Office International Des Epizooties (OIE). Avian infectious bronchitis In:____. Manual of standarts for diagnostic tests and vaccines. 2nd. ed. Paris, 1992, p. 549-561.

Origem: Instituto Biológico - www.biologico.sp.gov.br

Renato Luís Luciano possui graduação em Medicina Veterinária pela Universidade Federal de Uberlândia (2000) e mestrado em Microbiologia pela UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA/FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIA (2003). Atualmente é pesquisador científico do Instituto Biológico, Centro Avançado de Pesquisa Tecnológica do Agronegócio Avícola. Tem experiência na área de Medicina Veterinária, com ênfase em Sanidade Avícola, atuando principalmente nos seguintes temas: biologia molecular, PCR, RT-PCR, vírus da bronquite infecciosa das aves, sorologia de micoplasmoses aviárias, virologia molecular e diagnóstico viral

Contato: rluciano@biologico.sp.gov.br