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Bacteriocinas de bactérias lácticas: Utilização em laticínios e fatores que afetam a sua eficiência
Izildinha Moreno
As bactérias lácticas desempenham um papel primordial no processo de fermentação do leite, sendo sua utilização um dos métodos mais antigos de preservação. Isto se deve à sua capacidade de produzir ácido láctico rapidamente, ocasionando o decréscimo do pH do leite e a remoção da fonte fermentescível, promovendo um ambiente desfavorável ao desenvolvimento de microrganismos deteriorantes e/ou patogênicos. Além disso, essas bactérias produzem determinados compostos antagônicos formados em pequenas quantidades a partir do catabolismo celular, dentre os quais podemos citar as bacteriocinas.
As bacteriocinas são proteínas ou complexos de proteínas com atividade antibiótica, produzidas por determinadas linhagens de bactérias lácticas que se caracterizam por apresentarem em espectro de ação restrito aos microrganismos Gram positivos. Existem dois tipos de bacteriocinas: um tipo clássico, que exibe um espectro de atividade apenas contra as espécies homólogas e um segundo tipo, menos comum, que apresenta um amplo espectro de ação contra uma variedade de microrganismos Gram positivos (Quadro I). Como exemplo deste segundo tipo pode-se citar a nisina, produzida por determinadas linhagens de Lactococcus lactis subsp. lactis e a pediocina A produzida por Pedicoccus pentosaceus. Até o momento, somente a nisina foi suficientemente avaliada e purificada.
Muito se tem falado sobre o uso das bacteriocinas como agentes naturais de conservação de alimentos e um grande número de pesquisadores tem trabalhado na caracterização de novos tipos, apesar dessas substâncias terem sido descobertas há quase 70 anos atrás. Os primeiros registros datam do ano de 1928 quando, na produção de queijo, foi evidenciada a inibição do fermento láctico por bacteriocinas produzidas por bactérias lácticas presentes naturalmente no leite. Os primeiros resultados promissores na efetiva prevenção dos defeitos de estufamento tardio por bactérias anaeróbicas formadoras de esporos, em queijo tipo Suíço, foram apresentados em 1951, por um grupo de pesquisadores ingleses. A partir de então, várias pesquisas foram efetuadas, em diferentes países, com a utilização de nisina ou de linhagens produtoras desta bacteriocina na fabricação de diferentes produtos derivados de leite (Quadro II). Assim, queijos semiduros (Gouda, Edam) e queijos duros (Emental, Grana), fabricados com leite previamente contaminado com bactérias butíricas, utilizando-se culturas produtoras de nisina em adição ao fermento láctico não apresentavam os defeitos de estufamento butírico; porém, foi evidenciada uma série de problemas inerentes aos fermentos lácticos: acidificação muito lenta, promovendo dessoragem insuficiente e estufamento precoce causado por coliformes devido ao pH, defeitos de olhaduras ou aberturas, fraca proteólise e declínio rápido da concentração de nisina no queijo.
Essas pesquisas efetuadas a nível semi-industrial revelaram que o uso de linhagens produtoras de nisina era bastante eficiente na inibição dos deteriorantes butíricos e, de fato, protegia os queijos dos defeitos de estufamento; a ação inibidora, entre tanto, era exercida simultaneamente contra a microbiota desejável para o desenvolvimento de rápida acidificação e de outras transformações necessárias para a obtenção de um queijo de alta qualidade. Assim, a utilização de culturas mistas contendo linhagens produtoras de nisina e linhagens resistentes à nisina possibilitou a obtenção de queijos do tipo Edam de qualidade com sabor, aroma e textura característicos. No entanto, as limitações se relacionaram com as dificuldades da obtenção de culturas naturalmente resistentes e com características tecnológicas desejáveis, sendo necessário adaptá-las à nisina.
A aplicação direta da nisina purificada juntamente com fermentos lácticos resistentes foi avaliada na fabricação de queijo Tilsit, obtendo-se um produto de alta qualidade e sem problemas quanto à formulação de olhaduras; a adição direta da nisina ao leite de fabricação foi mais eficiente comparativamente à sua adição na salga ou por injeção no queijo fresco.
A nível industrial, um queijo semelhante ao Gouda, de alta qualidade, foi obtido com fermentos lácticos contendo linhagens produtoras de nisina e outras resistentes à nisina além do fermento láctico normalmente utlizado, não tendo sido verificado defeitosde estufamento butírico e nem precoce. Entretanto, 100 dias após a sua produção, ocorreu perda completa de acidificação, indicando a sensibilidade dessas culturas aos bacteriófagos, concluindo-se, portanto, que as linhagens produtoras de bacteriocinas deveriam ser resistentes a este vírus.
Nos últimos anos, devido à grande importância econômica das bactérias lácticas para a indústria de fermentação, os estudos sobre a fisiologia, bioquímica, genética, e biologia molecular das bacteriocinas tiveram um avanço significativo, permitindo a elucidação das estruturas e dos mecanismos de ação de muitos desses compostos. Além disso, o reconhecimento dos microrganismos Listeria Monocytogenes, Campilobacter jejuni e Escherichia coli 0157:H7 como principais patogênicos de alimentos fez aumentar o interesse no desenvolvimento de novos métodos para a obtenção de alimentos seguros. Com isto, as pesquisas relacionadas ao uso de linhagens produtoras de nisina foram retomadas por pesquisadores europeus visando à inibição de L. monocytogenes.
Muitos estudos demostraram a inibição desse patógeno in vitro, entre tanto, essa mesma efetividade não foi verificada na fabricação de queijo Camembert. De modo geral, esses estudos demostram que a utilização de culturas produtoras de bacteriocinas é influenciada por alguns fatores, sendo os principais: alto nível de contaminação inicial, valores de pH mais elevados no final da etapa de maturação do queijo devido ao crescimento de mofos, quantidades insuficientes de bacteriocina produzidas durante o processo de fabricação e a associação dessa molécula com algum componente do leite, em particular, a gordura. O mecanismo de ação dos lipídeos com a nisina, afetando a sua atividade, ainda não foi elucidado, tendo sido verificado que os fosfolipídeos são capazes de antagonizar a atividade da nisina in vitro.
Além do efeito sinergístico do ácido láctico e das bacteriocinas na inibição de microrganismos indesejáveis, observou-se que a adição de NaCl aumentou a eficiência de inibição da nisina contra L. monocytogenes e C. botulinum, em meios de cultivos, indicando em efeito combinado na redução da resistência dos esporos, aumentando a inibição do crescimento pós-germinativo. Verificou-se, contudo, uma redução da atividade da nisina produzida por L. lactis subsp. lactis, na etapa de salga durante a fabricação de queijo Cheddar. Os autores concluíram que o sal poderia ter interferido no desenvolvimento do microrganismo sensível utilizado no método de avaliação da atividade da nisina.
Como anteriormente exposto as bacteriocinas são pequenas moléculas protéicas sendo, portanto, susceptíveis à degradação por enzimas proteolíticas. Essa característica é importante na sua aplicação em alimentos em que enzimas ativas estão presentes seja como constituinte do próprio alimento ou restaurantes do metabolismo de microrganismos proteolíticos, como pode ser verificado em creme de leite pasteurizado pela correlação entre a degradação de nisina e a extensão da proteólise. A atividade da nisina diminuiu com o aumento da atividade proteolítica em amostras contaminadas com microrganismos Gram negativos.
Conforme demostrado para outros conservantes, a eficiência inibitória da nisina depende dos níveis de contaminação do alimento. Se a contaminação inicial for muito elevada, a atividade da nisina é restrita, não impedindo a deterioração do produto. Uma inibição efetiva do desenvolvimento pós-germinativo de esporos de C. botulinun tipos A e B em meio de cultivo e de L. mococytogenes V7 na fabricação de queijo Camembert foi obtido com baixos níveis de contaminação.
O estado fisiológico da linhagem sensível tem grande influência na susceptibilidade à ação letal das bacteriocinas, sendo que células metabolicamente ativas são mais sensíveis. Nesse sentido, verificou-se que células em fase exponencial de crescimento foram mais sensíveis à lacticina 481, lactostrepcina Las5, diplococcina 346 e à nisina.
Sabe-se que as linhagens produtoras de nisina apresentam baixas taxas de produção de ácido láctico e uma atividade proteolítica limitada, existindo evidências de que apresentaram maior sensibilidade aos bacteriófagos e à nisinase. Uma vez que a baixa produção de ácido láctico é um problema para a utilização de culturas produtoras de bacteriocinas na fabricação de queijos, diferentes sistemas de fermentos lácticos compostos de culturas produtoras de nisina foram avaliados visando à obtenção de níveis adequados de acidez na fabricação de queijo Cheddar. Com o uso de um transconjugante produtor de nisina, contendo um pasmídio de resistência, pode-se obter quantidades suficientes de ácido láctico, apesar das concentrações produzidas deste composto terem sido baixas. No entanto, esse mesmo transconjugante, em associação com outra linhagem produtora, forneceu uma concentração adequada de nisina durante a fabricação de queijo Cheddar, sem alterar as características organolépticas típicas deste queijo.
Uma modificação dessa técnica, visando ao aumento da quantidade de nisina na fabricação de queijo Cheddar, em meio com pH controlado foi proposta, verificando-se que o aumento da concentração do nível de nisina no meio de cultivo foi dependente da linhagem utilizada. De modo geral, as linhagens tiveram um aumento do número de células viáveis de 3 a 5 vezes e de nisina de 5 vezes. No queijo fabricado com esse fermento a produção de nisina foi 20% superior, tendo sido este aumento atribuído ao elevado número de células do inóculo.
Poucos são os trabalhos que citam a utilização direta da bacteriocina purificada na fabricação de queijos no intuito de inibir a contaminação pós-processamento por Listeria. Em um deles, conclui-se que o efeito combinado da produção de ácido láctico e da pediocina PA1 foi o responsável pela redução da população de L. monocytogenes na massa de queijo Cottage, enquanto que no creme, após a redução inicial, houve uma retomada do crescimento deste patógeno. Um aumento da vida-de-prateleira e o controle do desenvolvimento desta patógeno foi obtido com o uso de nisina comercial, na fabricação de ricota, cujo processo não depende de fermentação.
Por tudo exposto até o momento, a utilização mais adequada para a nisina é, sem dúvida, em queijos processados e em produtos termoprocessados, cujos processos térmicos normalmente aplicados eliminam totalmente a flora Gram-negativa, bactérias Gram-positivas não formadoras de esporos, leveduras e mofos mas são insuficientes para eliminar os esporos de clostrídios anaeróbicos deteriorantes como por exemplo, C. butyricum, C. tyrobytyricum e C. sporogenes, cuja presença resulta na produção de gás, alterações de aroma e na liquefação do queijo. O uso desta bacteriocina permite uma maior flexibilidade na formulação desse tipo de queijo, podendo-se reduzir os teores de sódio e/ou umidade.
A concentração mínima necessária para assegurar a qualidade do produto depende de vários fatores, dentre os quais, o nível de contaminação inicial de esporos na mistura de queijos, as temperaturas de aquecimento devido à perda de atividade de aproximadamente, 15% em temperaturas de 85-95ºC e das condições de estocagem (tempo e temperatura) do produto. Normalmente, a concentração usual é de 500mg/kg de produto, sendo adicionada à mistura de queijos na forma de pó juntamente com os sais fundentes ou em suspensão líquida, se a água se constituir em um ingrediente do produto. Para a efetiva utilização da nisina purificada deve-se estimar a quantidade de contaminação e a concentração necessária para a inibição. De qualquer forma, as concentrações a serem adicionadas devem seguir as normas estabelecidas nos padrões da legislação vigente.
Devido á sua temoresistência, a nisina é um conservante ideal para ser utilizado em alimentos de baixa acidez (pH4,5) contra deteriorações causadas por bactérias termófilas formadoras de esporos permitindo, dessa forma, uma redução da severidade do tratamento térmico e garantido a qualidade organoléptica e nutricional do produto. A adição de nisina ao leite achocolatado enlatado, previamente inoculado com B. stearothermophillus, em combinação com temperaturas reduzidas de esterilização, preveniu completamente a deterioração desse produto durante estocagem a temperatura ambiente.
Os resultados benéficos de estudos realizados sobre a adição de nisina em produtos de leite tratados termicamente foram relatados: a inibição do crescimento de microrganismos termófilos que sobreviveram às temperaturas de esterilização controle de deterioração e leite reconstituído e leite recombinado, completa inibição de bactérias formadoras de esporos e a redução do tempo de processo térmico de leite evaporado enlatado. Em produtos como pudins e sobremesas à base de leite e de leite achocolatado, o uso da nisina permitiu a redução das condições do tratamento térmico, sem prejuízos das características organolépticas ou problemas de gelatinização ou espessamento.
As bacteriocinas são relativamente estáveis ao aquecimento em alimentos ácidos, indicando que essas substâncias são bem adaptadas ao meio de desenvolvimento das bactérias produtoras; verificou-se, contudo, uma perda de atividade da nisina em alimentos de baixa acidez tratados termicamente. Foi reportada uma perda de 25 a 30% de atividade da nisina em alimentos de baixa acidez (pH 6,1 a 6,9) ou alta acidez (pH 3,3 a 4,5) após tratamento térmico a 121ºC durante 30 min.
Alguns estudos revelaram o aumento da vida útil de leite pasteurizado com o uso de nisina que promoveu a redução da população microbiana em temperaturas na faixa de 30 a 35ºC. A nisina é efetiva nesse tipo de produto somente quando ele não apresentar recontaminação por microrganismos Gram-negativos. Da mesma forma, em creme de leite pasteurizado, a adição de nisina promoveu o aumento da vida-de-prateleira pela inibição do crescimento de microrganismos mesófilos, de termodúricos e do desenvolvimento pós-germinativo de esporos durante o período de estocagem, sem alterações das propriedades organolépticas do produto, quando a contaminação pós-pasteurização não estava relacionada com os microrganismos Gram-negativos.
Observou-se, em iogurte, que o uso de nisina visado à racionalização do consumo de energia durante a estocagem refrigerada, permitiu o aumento da vida-de-prateleira do produto pelo controle da produção de ácido láctico e ácidos graxos devido, principalmente, à restrição do crescimento das bactérias lácticas. O produto manteve suas propriedades bioquímicas e sensoriais, sem alterações significativas de sabor, corpo, textura e de consistência.
A nisina apresenta estabilidade e atividade máximas em condições ácidas sendo adequada para utilização em alimentos ácidos. Isto foi verificado pela inibição mais pronunciada de L. monocytogenes em pH 5,5 que a pH 7,3, enquanto as condições mais favoráveis para a ação da nisina contra L. innocua LIN 11 se situam em valores de pH iguais ou inferiores a 6,5. Ela foi mais efetiva em prevenir o desenvolvimento pós-germinativo de esporos de 6 culturas de C. botulinum dos tipos A, B e E em caldo TPYG com pH de 5,5 e de 6,0 comparativamente a valores de pH de 7,0 a 8,0.
Estudos demostram uma maior efetividade da nisina na inibição de E. rhusiopathiae e de L. monocytogenes a temperaturas de 37ºC e uma leve redução da atividade a 22ºC. A produção de nisina por L. lactis subsp. lactis ATCC 11454 e a inibição do desenvolvimento pós-germinativo de esporos de C. botulinum foram verificados nas temperaturas de 4, 10, 15 e 35ºC, sendo que a efetividade aumentou nas temperaturas mais elevadas. Verificou-se, contudo, uma redução da atividade da nisina comercial contra C. botulinum 56A (100.000 esporos/ml) proporcionalmente com o aumento da temperatura de 15ºC para 35ºC.
Uma maior atividade de nisina contra L. innocua foi verificada às temperaturas de 15, 20, 25 e 30ºC que a 35ºC. Uma hipótese aventada pela aurora é que as células de L. innocua foram mais sensíveis devido às condições de injúria a que foram submetidas com a passagem da temperatura do pré-cultivo de 30ºC à temperatura de 15ºC no momento do teste. Em queijos processados adicionados de nisina com valores de pH de 5,6 a 6,0 e umidade de 54-58%, verificou-se uma perda 10, 40 e 60% de atividade com temperaturas de estocagem de 20, 25 e 30ºC, respectivamente, enquanto que em leite achocolatado esterilizado, a nisina apresentou-se fracamente estável a temperaturas de 37ºC e abaixo, com perda gradativa da atividade com o aumento da temperatura para 44ºC e, principalmente, para 55ºC.
Vários pesquisadores observaram uma redução acentuada da atividade das bacteriocinas após um período de incubação prolongado, sendo atribuída a vários fatores, entre os quais, às enzimas proteolíticas não específicas produzidas pelos próprios microrganismos produtores ou pela nisinase, à instabilidade nas condições de acidez crescente promovidas durante o último estágio de crescimento e pela adsorção às células produtoras. A redução da atividade da nisina com o tempo de estocagem, associada com a degradação desse composto, foi relatada em alguns produtos como o queijo Suíço, leite achocolatado, queijo processado e iogurte batido .
Conclusões
O uso de bacteriocinas como agentes antimicrobianos para inibir o crescimento de microrganismos patogênicos e/ou deteriorantes foi mostrada com sucesso com a nisina, o que resultou em seu uso comercial. Outras bacteriocinas produzidas por bactérias lácticas têm sido objeto de estudos recentes e podem, também, ter aplicação em alimentos. O uso efetivo de bacteriocinas requer informações com respeito às suas propriedades físicas, químicas e biológicas além de outros fatores como toxicidade e aspectos econômicos.
Atualmente, um elevado número de laboratórios está realizando pesquisas genéticas, a nível molecular, envolvendo a produção de bacteriocinas por bactérias lácticas. Quando informações mais detalhadas sobre a biossíntese e o mecanismo de ação dessas bacteriocinas estiverem disponíveis, será possível a obtenção de culturas geneticamente melhoradas com maior rendimento de produção e/ou a construção de variantes sem as características que limitam sua utilização prática na fabricação de produtos naturais e complexos como o queijo. É necessário ressaltar que, apesar do uso de bacteriocinas e/ou de suas culturas produtoras ser bastante válido para auxiliar no controle de microrganismos deteriorantes e/ou patogênicos, os métodos eficazes de limpeza e sanificação são imprescindíveis, em todas as etapas de obtenção da matéria-prima e de processamento, para evitar a contaminação do leite e dos produtos lácticos e, desta forma, obter um produto de alta qualidade.
Izildinha Moreno possui
graduação em Ciências Biológicas pela Pontifícia Universidade
Católica de Campinas (1983), mestrado em Ciências dos Alimentos pela
Universidade de São Paulo (1996) e doutorado em Ciências dos
Alimentos pela Universidade de São Paulo (2003). Atualmente é
pesquisador científico VI do Instituto de Tecnologia de Alimentos.
Tem experiência na área de Ciência e Tecnologia de Leite e
Derivados, com ênfase em Fisiologia Metabolismo Taxonomia e
Utilização Industrial de Bactérias Lácticas, atuando principalmente
nos seguintes temas: bactérias lácticas, fermentos lácticos,
bacteriocinas, caracterização, inibição e leite.
Alda Luiza Santos Lerayer possui graduação em Engenharia Agronômica pela Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (1974), especialização em Caract. de Bactérias Lácticas Prod. de Bacteriocinas pela Laboratoire de Technologie Laitière (1990), especialização em Caract. de Bactérias Lácticas Prod. de Bacteriocinas pela Laboratoire de Technologie Laitière (1999), mestrado em Microbiologia Agrícola pela Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (1979), doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas pela Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (1985) e pos-doutorado pela Laboratoire de Génétique Microbienne (1996). Atualmente é Pesquisador Científico VI do Instituto de Tecnologia de Alimentos. Tem experiência na área de Genética , com ênfase em Genética Molecular e de Microorganismos. Atuando principalmente nos seguintes temas: Lactococcus, Bacteriófago, resistência, Restrição - Modificacão, Laticínios e Bactéria láctica.
Mauro Faber de Freitas Leitão - Pesquisador Científico VI do Instituto de Tecnologia de Alimentos - ITAL.
Dados para citação bibliográfica(ABNT): MORENO, I.; LERAYER, A.L.S.; LEITÃO, M.F.F. Bacteriocinas de bactérias lácticas: Utilização em laticínios e fatores que afetam a sua eficiência. 2008. Artigo em Hypertexto. Disponível em: <http://www.infobibos.com/Artigos/2008_3/bacteriocinas/index.htm>. Acesso em: Publicado no Infobibos em 20/09/2008
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