FATORES DETERMINANTES DO SUCESSO DE UM PROGRAMA DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM BOVINOS.
(DETERMINING FACTORS FOR THE SUCCESS OF A BOVINE EMBRYO TRANSFER PROGRAM.)

por Rafael Herrera Alvarez

A transferência de embriões (TE) pode ser definida como o processo de remover um ou mais embriões do trato reprodutivo de uma fêmea doadora e transferi-los a uma ou mais fêmeas receptoras. Os embriões também podem ser produzidos no laboratório utilizando técnicas de fecundação in vitro ou por clonagem de células embrionárias ou somáticas. Entretanto, considerando que a transferência de um embrião é somente uma de uma série de etapas destinadas à obtenção de uma gestação por essa via, o termo TE, no sentido mais amplo, considera também os processos de superovulação e inseminação das doadoras, coleta de embriões, isolamento, avaliação e cultura dos embriões durante um curto período, micromanipulação (com finalidade de sexagem ou genotipagem), congelamento e transferência dos embriões.

Desde o nascimento dos primeiros produtos oriundos dessa tecnologia (Heape, 1890), a TE foi utilizada como ferramenta auxiliar nas pesquisas com reprodução animal, sendo que sua aplicação comercial ocorreu somente a partir da década de 1980.

Atualmente, a industria da TE é um negócio de escala internacional. Para os interessados em conhecer um pouco mais a história do desenvolvimento da tecnologia da TE recomenda-se a leitura da excelente revisão sobre esse tópico feita recentemente por Betteridge (2003 ).

Nos últimos 25 anos, foram poucos os avanços conseguidos para melhorar a resposta aos tratamentos de superovulação. Isso pode ser mostrado da análise do número médio de embriões recuperados de vacas superovuladas em uma central norte-americana de TE (Em Tran Inc.). Em 1979, a média de embriões recuperados era de 4,6 contra 4,8, vinte anos depois (Hasler, 2003). Esses dados consideram todas as doadoras superovuladas, independentemente de não terem manifestado cio, ou não terem sido coletadas devido à falta de resposta ovariana. Com efeito, um sério problema, ainda sem solução, é que, aproximadamente, 20% das doadoras não produzem embriões transferíveis (Tabela 1).

Nº de embriões 0 Menos que 3 3 a 6 Mais que 6 % vacas 20% 10% 45% 25% Embora a produção média de embriões por doadora não tenha sido aumentada significativamente, houve um avanço considerável na flexibilidade para a aplicação dos tratamentos. Essa melhora foi possível graças ao uso de dispositivos liberadores de progesterona aplicados por via vaginal ou subcutânea (Bo et al., 2006). Atualmente, a superovulação pode ser iniciada após a inserção de um dispositivo liberador de progesterona em qualquer momento do ciclo estral. Por outro lado, tem sido claramente demonstrado que não existe qualquer beneficio do intervalo de espera da manifestação de dois cios consecutivos entre superovulações, como inicialmente acreditado. As doadoras podem ser superovuladas repetidamente cada 40 dias, durante um período de 1 a 2 anos, com resultados satisfatórios (Hasler, 2003).

Após a ampla aceitação da recuperação não cirúrgica de embriões desde os anos 80s, os procedimentos para recuperar embriões têm recebido pouca atenção. Praticamente, todos os técnicos de TE utilizam um cateter tipo Foley, com um .balão. inflável na extremidade para fixar o cateter no útero. Tradicionalmente, as sondas de Foley eram compostas de borracha ou látex. Recentemente, o silicone foi utilizado para substituir esses materiais na confecção das sondas específicas para bovinos. Essas sondas apresentam várias vantagens, incluindo a capacidade de suportar a esterilização em autoclave, manutenção da forma concêntrica do balão, bem como múltiplas saídas de drenagem. A maior parte dos técnicos opta por utilizar um grande volume de líquido (um ou dois litros de PBS), sendo que a metade é introduzida por fluxo de gravidade em cada corno uterino, embora exista uma crescente opinião que o PBS pode ser liberado no corpo do útero de forma a realizar a .lavagem. simultânea dos dois cornos uterinos. Nesse caso, o balão é inflado logo depois de passar a cervix. A eficiência da coleta parece ser semelhante nos dois procedimentos. Uma prática interessante após a coleta consiste em encher os cornos uterinos com PBS, bloquear a saída da sonda e soltar o animal no curral enquanto é realizada a procura dos embriões. Caso não sejam encontrados embriões (ou encontrado um número muito inferior ao número de corpos lúteos), os animais serão novamente coletados. Com essa prática, alguns técnicos tem aumentado em aproximadamente 2 a 3 o número médio de embriões recuperados (Netto et al., 2005).

No início, a indústria comercial de TE utilizava o mesmo meio (PBS suplementado com soro) para realizar a coleta e a conservação dos embriões. Atualmente, várias empresas oferecem meios mais complexos, elaborados especificamente para atender as diversas etapas da TE. Embora esses produtos ofereçam uma maior .segurança psicológica. ao técnico, não existe evidência científica convincente demonstrando que o uso desses produtos resulte em uma melhora significativa da qualidade após a coleta ou das taxas de prenhez. Atualmente, a avaliação dos embriões é relativamente bem padronizada, tanto para o estágio de desenvolvimento, como para a qualidade embrionária. As definições desses dois conceitos estão disponíveis no Manual editado pela Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS). Apesar de existir vários procedimentos (metabólicos, capacidade de desenvolvimento em cultura, etc) para estimar a viabilidade dos embriões, atualmente só a avaliação morfológica (utilizando microscopia ótica) é utilizada para avaliar a qualidade dos embriões. Existe uma boa correlação entre a qualidade morfológica dos embriões e a posterior taxa de prenhez (Alvarez et al., 2007).

A qualidade do embrião é sabidamente um fator de grande relevância na taxa de prenhez. Contudo, os técnicos que trabalham nas fazendas (ou mesmo nas centrais de TE) têm pouca escolha com relação a esta variável no momento de realizar a transferência. Por outro lado, a condição da receptora pode influenciar as taxas de prenhez. Em raças européias, o uso de vacas e novilhas de corte e novilhas leiteiras resulta em taxas de prenhez semelhantes, enquanto que vacas leiteiras apresentam uma taxa de prenhez consideravelmente menor.

Diversos estudos direcionados a melhorar as taxas de prenhez das receptoras utilizando hormônios (progesterona, hCG, bSTr, GnRH) ou outras drogas (banamine, clenbuterol) não apresentaram resultados consistentes.

A conservação de embriões bovinos congelados é um procedimento comercialmente viável desde os anos 80s, resultado das pesquisas pioneiras realizadas na Universidade de Cambridge (Polge e Willadsen, 1978). Inicialmente, o glicerol foi a principal substância utilizada como crioprotetor das células embrionárias. O inconveniente dessa tecnologia era a necessidade de descongelar as palhetas e realizar a avaliação morfológica antes de realizar a transferência. Para tanto era necessário dispor de um microscópio, um meio especifico de descongelamento e um embriologista treinado para fazer a avaliação do embrião no momento da descongelação.

O uso do etileno glicol como um crioprotetor, no lugar do glicerol fez possível a transferência do embrião diretamente no útero da receptora, sem necessidade de retirar o embrião da palheta em que foi congelado. Essa inovação representou uma melhora significativa no campo da TE nos anos 90s. Como as taxas de prenhez são semelhantes entre os embriões congelados com glicerol e etileno glicol, atualmente o etileno glicol é o crioprotetor predominante na maior parte dos programas comerciais de TE. As taxas de prenhez que resultam da transferência de embriões congelados e descongelados são atualmente, aproximadamente, 10% menores que as obtidas com embriões frescos de qualidade semelhante.

O termo FIV (Fecundação in vitro) envolve a produção de embriões produzidos in vitro e inclui as etapas de maturação, fecundação e cultura in vitro, até o estágio de mórula ou (mais freqüentemente) blastocisto. A padronização laboratorial das condições ambientais (temperatura, umidade, etc) para realizar a FIV, fez com que no inicio dos anos 90s, várias empresas, que atuavam no ramo da TE, começassem a oferecer programas de FIV em base comercial. A produção comercial de embriões FIV rapidamente alcançou um grande sucesso e como resultado milhares de prenhezes foram estabelecidas. Infelizmente, um número significativo de gestações foi caracterizado por aborto, dificuldades ao parto, morte perinatal ou anomalias dos bezerros (Smith, 2007). Devido a esses problemas, a demanda pelos serviços de FIV nos EUA declinou significativamente. Nos últimos anos, contudo, esses problemas têm sido reduzidos pelo uso de sistemas de cultura com meios semidefinidos em substituição ao soro fetal e/ou co-cultura. Atualmente, Brasil é o maior usuário mundial da tecnologia de FIV, sendo que o número de transferências utilizando embriões produzidos por FIV ou recuperados de vacas superovuladas é muito próximo. Acredita-se que, no futuro, o procedimento da FIV para a produção de embriões deverá substituir a TE tradicional, envolvendo superovulação e coleta uterina dos embriões.

Os primeiros bezerros clones nascidos originaram-se da divisão de embriões em duas metades (Ozil et al., 1982). Esta técnica deve ser realizada com auxílio de um micromanipulador (manualmente também é possível, mas requer uma boa habilidade e experiência prévia do operador na manipulação de embriões). A bipartição possibilita um aumento no número de bezerros produzidos de um determinado grupo de embriões e também a produção de gêmeos idênticos, oriundos de alguns desses embriões. Entretanto, esta tecnologia atualmente é menos utilizada que durante os anos 80s, período em que a técnica ficou disponível.

A clonagem de bovinos adultos pela transferência do núcleo de células somáticas é uma área que atualmente vem recebendo grande atenção na imprensa e em laboratórios de pesquisa acadêmica. A comercialização de bovinos originados por essa tecnologia ainda é bastante limitada. No Brasil, o comércio de clones é limitado ao mercado especulativo de animais de excepcional valor comercial (vide caso do famoso touro .Bandido., utilizado em rodeios), bem como atender a demanda na preservação de raças nativas ou adaptadas, em vias de extinção.

Como o comércio internacional de embriões congelados entre países cresceu rapidamente nos anos 80s, atenção considerável foi dada ao estudo das eventuais doenças transmitidas pelo embrião quando transferido fresco ou congelado. Como resultado, atualmente devem ser respeitados procedimentos específicos de produção e manipulação dos embriões destinados ao movimento entre países (Stringfellow et al., 2004). Esses protocolos têm provado ser bastante eficientes e não existe notícia de qualquer problema sanitário relacionado com a transmissão de doenças pelo embrião transportado internacionalmente. Entretanto, os protocolos existentes aplicam-se a embriões produzidos in vivo, de forma que mais pesquisas são necessárias para desenvolver regulamentos sanitários mais específicos para o comercio internacional de embriões produzidos in vitro, clones e embriões transgênicos. Devido aos recentes eventos internacionais de aparecimento de doenças de importância econômica (febre aftosa) e/ou que afetam à saúde humana (BSE), é altamente provável que o uso de meios de cultura sem a presença de produtos de origem animal será obrigatória para a manipulação e congelamento de embriões bovinos.

ALVAREZ, R.H. et al. Transfer of bovine blastocysts derived from short-term in vitro culture of low quality morulae produced in vivo. Reproduction of Domestic Animals (OnlineEarly Articles). doi:10.1111/j.1439-0531.2007.00884.x, 2007.

BETTERIDGE, K. J. A history of farm animal embryo transfer and some associated techniques. Animal Reproduction Science, Amsterdam, v.79, n.3, p.203-244, 2003.

BÓ, G.A., GUERRERO, D.C., ADAMS, G.P. Alternative approaches to setting up donor cows for superstimulation. Theriogenology, Amsterdam, v.69, n.1, p.:81-87, 2008.

HASLER, J.F. Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in cattle.

Theriogenology, Amsterdam, v.56, n.9, p.1401-1415, 2001; HASLER, JF. The current status and future of commercial embryo transfer in cattle.

Animal Reproduction Science, Amsterdam, v.79, n.3, p.245-264, 2003.

HEAPE, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London, London, v.48, p.457.

NETTO, A.S. et al. Improvement in embryo recovery using double uterine flushing.

Theriogenology, Amsterdam, v.63, n.5, p.1249-55, 2005.

OZIL, J.P., HEYMAN, Y., RENARD, J.P. Production of monozygotic twins by micromanipulation and cervical transfer in the cow. Veterinary Record, London, v.110, n.6, p.126-127, 1982.

Cryobiology, Amsterdam, v.15, n.3, p.370-373, 1978.

SILVA, J.C.C. et al. Factors affecting the embryos production of superovulated zebu cows.

Animal Reproduction, Belo Horizonte, 2008 (no prelo).

SMITH, C.L. Alterações genéticas e epigenéticas em embriões produzidos in vitro. XVII Congresso Brasileiro de Reprodução Animal. . Curitiba, PR, - Animal Reproduction, Belo Horizonte v.31, n.1, p.241-246, 2007.

STRINGFELLOW, D.A., GIVENS, M.D., WALDROP, J.G. Biosecurity issues associated with current and emerging embryo technologies. Reproduction, Fertility and Development, Collingwood, Australia, v.16, n.1-2, p.93-102, 2004.