Diagnóstico molecular do nematóide das lesões Pratylenchus brachyurus

Andressa Cristina Zamboni Machado
Cláudio Marcelo Gonçalves Oliveira

 

Figura 1. Nematóide das lesões radiculares, Pratylenchus brachyurus

Os nematóides das lesões (gênero Pratylenchus) são parasitos comuns de plantas em todo o mundo. São considerados, depois dos nematóides causadores de galhas (Meloidogyne spp.), como os parasitos que causam maiores perdas econômicas na agricultura mundial. Invadem o parênquima cortical das raízes, produzindo extensas áreas necróticas e causando sérias perdas econômicas. Pratylenchus brachyurus é um nematóide que ocorre com elevada freqüência em culturas importantes do Brasil, como soja, café, cana-de-açúcar, algodão, entre outras.

O controle de P. brachyurus é bastante difícil e a busca por novas alternativas de manejo desse nematóide é complicada, uma vez que é uma espécie com grande número de plantas hospedeiras, o que inviabiliza o uso da rotação de culturas, e parece não existir fontes de resistência a P. brachyurus nas principais espécies vegetais cultivadas atualmente no Brasil. Além disso, o sucesso de programas de manejo de nematóides muitas vezes depende da rápida e segura identificação da espécie presente na área.

O gênero Pratylenchus apresenta certas dificuldades de identificação devido ao fato de muitas características morfométricas e morfológicas serem comuns entre espécies, além da grande variabilidade morfológica dentro das espécies. Amostragens a campo tornam-se tarefas complicadas quando mais de uma espécie de Pratylenchus está presente nas amostras. A identificação dessas espécies pode ser simplificada, através do desenvolvimento de métodos que levem em conta caracteres menos variáveis, com base em um único espécime, como a técnica de PCR (reação em cadeia da polimerase), utilizando-se primers específicos (pontos de iniciação para a reação de polimerização). Este método pode ser utilizado como uma ferramenta para diagnóstico rápido e eficiente em estudos de epidemiologia e manejo de nematóides do gênero Pratylenchus. Para algumas espécies desse gênero, há a disponibilidade de primers para sua correta identificação, como é o caso de P. penetrans, P. coffeae, P. loosi, P. neglectus, P. scribneri, P. thornei e P. vulnus. Entretanto, primers específicos para P. brachyurus, uma espécie de grande importância para as condições brasileiras, ainda não haviam sido devidamente caracterizados

Figura 3. Pratylenchus brachyurus no interior de raiz de algodoeiro

Figura 4. Lesões em raiz de algodoeiro causadas por Pratylenchus brachyurus

Figura 5. Teste de PCR (primer específico) com 26 populações de P. brachyurus

Nesse sentido, um protocolo utilizando a técnica de PCR para diagnóstico de Pratylenchus brachyurus foi desenvolvido pela pesquisadora Andressa C. Z. Machado, contando com a supervisão do Dr. Cláudio Marcelo G. Oliveira, do Centro Experimental Central do Instituto Biológico (CEIB) e do Prof. Luiz Carlos C. B. Ferraz, da ESALQ/USP. O projeto recebeu o apoio financeiro da Fundação de Apoio à Pesquisa no Estado de São Paulo, FAPESP. A região ITS-1 do DNA ribossômico de P. brachyurus foi amplificada a partir de primers universais, seqüenciada no Laboratório de Bioquímica Fitopatológica do IB e comparada entre si, de forma a identificar as seqüências potenciais com utilidade para o estabelecimento de primers específicos. “Essa região foi escolhida, pois ocorre em um grande número de cópias dentro do genoma da espécie, o que facilita sua amplificação via PCR, além de ser bastante utilizada para o estudo de estruturas populacionais e para fins de diagnóstico em nematologia”, explicam os pesquisadores.

No total foram analisadas 29 populações de P. brachyurus coletadas em áreas agrícolas em diferentes regiões do Brasil, e também com a participação da Clínica Nematológica da ESALQ/USP, supervisionada pelo Dr. Mário M. Inomoto, no fornecimento de amostras contendo a espécie. Essas populações de P. brachyurus foram identificadas morfologicamente e utilizadas na validação do primer específico. “Obtivemos a seqüência da ITS-1 de três populações de P. brachyurus, que foram comparadas com seqüências de outras espécies de Pratylenchus disponíveis em banco de dados on-line, para o desenvolvimento do primer específico”, revela. “O primer selecionado foi testado junto às 29 populações coletadas e os resultados foram bastante confiáveis”, salienta a pesquisadora.

O desenvolvimento de um primer específico para P. brachyurus representa importante contribuição à diagnose dessa espécie, uma vez que é um método rápido e que pode ser utilizado na rotina de laboratório, além de não exigir serviço de técnicos altamente especializados. A justificativa para a aplicação desse método também é relacionada ao aumento da demanda de solicitações para identificação de nematóides. “A identificação de nematóides baseada na morfologia está se tornando incapaz de atender ao grande número de pedidos”, afirmam os pesquisadores do Laboratório de Nematologia do IB. “Por isso, as técnicas moleculares são essenciais para identificar fitonematóides”, completam. Os resultados dessa pesquisa estão sendo divulgados através de publicação em revista de circulação internacional (Machado et al., 2007, Nematropica, v.37).

Além disso, a análise das seqüências de P. brachyurus obtidas revelou a existência de variabilidade genética dentro da espécie, o que está sendo investigado atualmente em projeto de pós-doutoramento da pesquisadora Andressa Machado, no CEIB, em Campinas, sob a supervisão do Dr. Cláudio Marcelo G. Oliveira e também financiado pela FAPESP. “Vamos estudar também P. coffeae, outra importante espécie que ocorre no Brasil, em relação à variabilidade genética já verificada em trabalhos prévios”, completa. Segundo a pesquisadora, a análise dessas espécies poderá vir a proporcionar o entendimento das variações genéticas entre e dentro das populações, o que vem sendo observado no campo em diferentes plantas hospedeiras, além de confirmar a confiabilidade dos protocolos desenvolvidos e descritos anteriormente. O projeto interinstitucional (Instituto Biológico e ESALQ) está previsto para terminar em 2009, quando a equipe de pesquisadores envolvidos espera elucidar as controvérsias taxonômicas encontradas, além de identificar a natureza da variabilidade genética dentro do gênero.

Figura 2. Efeito de Pratylenchus brachyurus em cafeeiro Mundo Novo (0, 2, 6, 18 e 54 nematóides por cm3 de solo)

Andressa Cristina Zamboni Machado possui graduação em Engenharia Agronômica pela Universidade de São Paulo (2001) e doutorado em Agronomia (Fitopatologia) pela Universidade de São Paulo (2006) e Pós-doutoranda (Fapesp). Tem experiência na área de Agronomia, com ênfase em Fitopatologia, atuando principalmente nos seguintes temas: algodão, Pratylenchus brachyurus, nematóide das lesões radiculares, biologia molecular de nematóides e testes de patogenicidade e resistência/suscetibilidade.
Contato: andressa@biologico.sp.gov.br

Cláudio Marcelo Gonçalves Oliveira  é Engenheiro Agrônomo formado pela ESALQ/USP em 1993, mestre em ciências pela mesma universidade em 1996 e concluiu o doutorado no Scottish Crop Research Institute - University of Dundee, Dundee, Escócia, em 2004. Atualmente é Pesquisador Científico do Laboratório de Nematologia do Centro Experimental Central do Instituto Biológico (CEIB). Recebeu o prêmio SABRI 2004. Atua na área de Agronomia, com ênfase em Nematologia.  Em seu currículo Lattes os termos mais freqüentes na contextualização da produção científica, tecnológica e artístico-cultural são: nematóide, café, resistência, Taxonomia, algodão, controle químico, distribuição, filogenia, Longidoridae e diagnostico molecular
Contato: marcelo@biologico.sp.gov.br

MACHADO, A.C.Z.; OLIVEIRA, C.M.G. Diagnóstico molecular do nematóide das lesões Pratylenchus brachyurus. 2007. Artigo em Hypertexto. Disponível em: <http://www.infobibos.com/Artigos/2007_3/diagnostico/index.htm>. Acesso em: